Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь

Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь

PtdIns синтезируются в АГ и потом транспортируются к плазматической мембране, обычно, в измененном виде. Так, сходу после синтеза PtdIns фосфорилируется PI4-киназой. Дополнительное фосфорилирование по 5-му положению делает на мембране веб-сайт связывания фактора GEF для Arf1, что провоцирует формирование экзоцитозных пузырьков при помощи GGA-окаймлений. После встраивания экзоцитозного пузырька Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь в плазматическую мембрану PI(4,5)P2 участвует в заякоривании актинового цитоскелета на мембране через актин-связывающие белки. Не считая того, он фосфорилируется PI3-киназой p85, превращаясь в PI(3,4,5)P3. Не считая ассоциации с сигнальными белками, этот липид участвует в формировании поверхностных протрузий, раффлов, нередко дающих начало макропиносомам. Любопытно, что PI(4,5)P2 практически Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь работает координатором экзо- и эндоцитозных потоков, позволяя сохранять баланс мембран в случаях отсутствия особых сигналов, провоцирующих повышение площади мембраны в данном участке, так как белок семейства синаптотагминов, инициирующий сборку клатринового окаймления, ведет взаимодействие как раз с теми участками мембраны, которые содержат PIP2. Таким макаром, уравновешивается количество пузырьков Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, встроившихся в мембрану в итоге экзоцитоза, и отшнуровавшихся эндосом.

Все эти реакции фосфорилирования происходят не только лишь в определенном месте, да и регулируются во времени. К примеру, PI3-киназа p85 активизируется при действии на клеточку ростовых причин, и только тогда в мембране возникает PIP3. Фосфатазы, осуществляющие дефосфорилирование, также подвержены регуляции Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь разными сигналами, таким макаром, существование определенных фосфорилированных форм PtdIns верно контролируется сигнальной машинерией клеточки.

6.4.2. Фосфоинозитиды на эндоцитозном пути.
Механизм деяния Vps34

Ранее уже говорилось о том, что для эндоцитозного пути типично существование липидных территорий, обогащенных PI3-монофосфатом. Этот липид возникает на мембранах ранешних эндосом последующим образом (рис. 31): активированный Rab5 рекрутирует Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь к мембране вспомогательную субъединицу Vps34, p150. Р150 миристилирована и может, таким макаром, заякориваться в мембране. Хотя один из ее доменов обладает высочайшей степенью гомологии с ферментативным доменом серин-треониновых протеинкиназ, но ни субстраты р150, ни ее многофункциональная роль в этом качестве неопознаны. Связывание р150 с эндосомой вызывает рекрутирование из Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь цитоплазмы Vps34, которая фосфорилирует молекулы PtdIns в конкретной близости от себя, создавая домены, обогащенные PI3-монофосфатом. Этот домен играет, по последней мере, тройную роль: во-1-х, к нему рекрутируется фактор дистанционного взаимодействия ранешних эндосом EEA1(early endosomal autoantigene1), что провоцирует гомотипическое слияние ранешних эндосом и их укрупнение. Во Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь-2-х, к этой платформе рекрутируются так именуемые ESCRT 0-IV комплексы, которые концентрируют тут грузы, направляемые на деградацию, через поздние эндосомы.

Рис. 31. Этапы эндоцитозного пути, в регуляцию которых
вовлечена PI3-киназа Vps34

И в конце концов, из PI3P-доменов формируются инвагинации, дающие начало внутренним пузырькам поздних эндосом. Таким макаром Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, сконцентрированный груз удаляется с наружной мембраны эндосомы и лишается способности рециклировать. Каким образом PI3P содействует искривлению мембраны в подходящем направлении, непонятно, но при ингибировании активности Vps34 вортманнином получаются очень большие эндосомы без внутренних пузырьков, имеющие свойства ранешних эндосом (рис. 32)

а)

б)

Рис. 32. Ингибитор PI3-киназ вортманнин Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь приводит
к появлению увеличенных эндосом (а) и тубуляции
рециклирующих (б), не оказывая эффекта на мембраны АГ

На рис. 32: а – иммунофлуоресцентное выявление эндосом, содержащих сенсор ЭФР, в клеточках А431, через 60 мин после стимуляции эндоцитоза; б – клеточки окрашивали антителами на рециклирующий сенсор трансферрина (верхняя панель) и на маркер мембран АГ сенсор ERD2 (нижняя панель) до Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь (контроль) и через 30 мин после прибавления вортманнина. Микрофоторгафии Н. Н. Железновой.

.То, что невозможность формирования внутренних пузырьков МВЭ существенна для созревания ранешних эндосом в поздние, подтверждает и угнетение вортманнином деградации грузов, направляемых в лизосомы. Подразумевается, что рециклирование из поздних эндосом регулируется очередной фосфатидилинозитолкиназой, – PI3P5K, именуемой Fab Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь1, субстратом которой является PI3-монофосфат.

Не считая того, понятно, что РI3P на внутренней мембране аутофагосомы на всех стадиях ее формирования.

6.4.3. Механизм деяния фосфорилированых
форм PtdIns

Как уже упоминалось, регуляторная роль PtdIns связана с тем, что ряд белков обладает доменами, способными узнавать их определенные фосфорилированные формы и рекрутироваться Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь к мембране в тех веб-сайтах, где они локализованы. Таких доменов на реальный момент идентифицировано три (рис. 33) – так именуемый РН (plekstrin homology) домен, PX-домен, идентифицированный в первый раз в составе оксидазы p47Phox, и FYVE-домен, заглавие которого является аббревиатурой заглавий белков Fab1 (PI3P5-киназа, обеспечивающая рециклирование Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь из поздних эндосом), YotB (предположительно – гидролаза бактериального происхождения), дрожжевого белка Vac1, ответственного за сортировку эндоцитировннного груза в вакуоль, и уже известного EEA1. Большей спецификой владеют FYVE- и РХ-домены, узнающие только PI3P. FYVE-домен содержат также некие составляющие эндосомных сортирующих комплексов ESCRT. РХ-домен найден в белках, регулирующих отдельные Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь стадии эндоцитозного пути, к примеру, в SNARE Syn3 и Vam7p. PH-домен малоспецифичен и ведет взаимодействие со всеми фосфо-формами PtdIns. Его содержат такие белки, как динамин, ARNO (GEF для ARF1), сигнальные белки PLCdelta, Akt-киназа и адаптерный белок Sos, связывающий тирозинкиназные сенсоры с МАР-киназным каскадом.

Рис. 33. Белковые Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь домены, узнающие определенные
фосфорилированные формы фосфоиннозитидов. Понизу
приведены примеры белков, владеющих надлежащими
доменами. Расшифровки заглавий даны в тексте

Таким макаром, фосфорилирование PtdIns является механизмом, регулирующим рекрутирование определенных белков к определенным мембранным веб-сайтам, при этом исходя из убеждений специфики эндоцитозный путь занимает особенное положение – на эндосомах работает уникальный фосфоинозитид Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, а взаимодействующие с ним белки владеют уникальными доменами узнавания этого липида.

7. РОЛЬ УБИКВИТИНИРОВАНИЯ
В РЕГУЛЯЦИИ ВЕЗИКУЛЯРНОГО
ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ

Убиквитинированием именуется ковалентное присоединение маленького ограниченного белка убиквити́на (от англ. ubiquitous — всесущий), экспрессируемого во всех клеточках эукариот. Присоединение осуществляется через образование изопептидной связи меж С-концевым глицином убиквитина и лизиновым остатком белка Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь-мишени (рис. 34).

Рис. 34. Схематичное представление присоединения молекулы
убиквитина к белку-мишени

О существовании таковой посттрансляционной модификации самых разных белков было понятно издавна, но функциональное значение ее несколько десятилетий оставалось неясным. В 2004 г долголетние исследования Аарона Чехановера, Аврама Гершко и Ирвина Роуза были удостоены Нобелевской премии по химии «за открытие убиквитин Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь-опосредованной деградации белка». Они проявили, что белки, «меченые» пришитыми к ним длинноватыми цепочками из убиквитина, узнаются цитоплазматическими 26S- протеасомами. Таким макаром, убиквитинирование стало восприниматься как «метка смерти» для цитоплазматических белков. В отличие от лизосом, при помощи протеасом уровень белков в цитоплазме можно изменять очень стремительно. Последующие исследования проявили Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, что убиквитинирование вовлечено в такие принципиальные процессы, как регуляция пролиферация, развитие и дифференцировка клеток, реакция на стресс и патогены, репарация ДНК, избавление от некорректно свернутых либо дефектных вновь синтезированных белков.

Но далековато не все эти процессы связаны с деградацией убиквитинированных белков в протеасомах. Оказалось что многие трансмембранные белки, а именно Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь рецепторные, дергадируют в лизосомах, но при всем этом подвергаются убиквитинированию. Достаточно длительно было непонятно, как разрешить это протворечие.

7.1. ТИПЫ УБИКВИТИНИРОВАНИЯ: МОНО-,
МУЛЬТИ- И ПОЛИУБИКВИТИНИРОВАНИЕ

Так как сам убиквитин имеет в собственном составе несколько остатков лизина (в 11, 29, 48 и 63 положениях), он также может быть мишенью убиквитинирования. В итоге могут получаться цепи, связанные через Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь различные остатки лизина и содержащие различное количество молекул убиквитина. Также выяснилось, что убиквитин и/либо убиквитиновые цепи способны по-разному присоединяться к белкам–мишеням.

Так, к лизину белка-мишени может присоединяться одна молекула убиквитина. Таковой тип модификации именуется моноубиквитинированием. О полиубиквитинировании молвят, если к одному либо нескольким лизинам Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь белка-мишени присоединены длинноватые убиквитиновые цепочки, при этом длина может быть различной. Сначало считали, что полиубиквитинирование является универсальным типом модифицирования белков, но потом было выяснено, что существует к тому же смешанный тип модификации, когда к множественным лизинам белка присоединяются как единичные молекулы убиквитина, так и цепочки. Таковой тип в Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь большинстве случаев именуют мультиубиквитинированием. Так как главным методом детекции убиквитинированных белков сначало был одномерный электрофорез с следующим иммуноблоттингом, то различить мульти- и полиубиквитинирование было фактически нереально, так как в обоих случаях различные убиквитинированные формы белка выявлялись как длинноватая слошная зона выше немодифицированного белка. По-английски ее вид Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь нередко характеризуется как «slurry» (водянистая грязь, кашица). Таковой поведение измененного белка при электорфорезе гласит о том, что мишени, обычно, модифицируются обилием цепочек разной длины сразу.

Применение масс-спектрометрии в композиции с генно-инженерными подходами позволило выявить последующие детали. Оказалось, что важен не только лишь тип модификации, да и то, через какой Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь остаток лизина формируется убиквитиновая цепочка. Так, в качестве сигнала протеасомной деградации воспринимаются убиквитиновые цепочки более чем из 8-ми молекул, соединенных через Lys48 убиквитина. Конкретно такие цепочки участвуют в полиубиквитинировании. Еще более необъятными функциями владеют цепочки, образованные через Lys63. Измененные ими белки участвуют в процессах репарации ДНК, трансляции, активации Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь сигнальных белков (к примеру, активации киназы IkappaB) и, что более значительно в рамках нашей темы, в регуляции эндоцитоза. Цепочки, присоединяемые к белку при мультиубиквитинировании, обычно, содержат до 4 молекул убиквитина, связанных конкретно через Lys63. Таким макаром, тип цепи определяет реакции, в каких участвует убиквитинированный белок.

Моноубиквитинирование, обычно, работает как Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь нехороший регулятор активности белков либо их взаимодействий, хотя есть и другие данные. В общем, можно утверждать, что на сегодня регуляторные функции убиквитинирования еще далеки от полной расшифровки.

7.2. УБИКВИТИН-КОНЪЮГИРУЮЩАЯ СИСТЕМА. ДЕУБИКВИТИНИРОВАНИЕ.
УБИКВИТИН-УЗНАЮЩИЕ ДОМЕНЫ

Внутриклеточные макромолекулы, как понятно, подвергаются огромному количеству ковалентных модификаций. Фосфорилирование, метилирование и др. играют важную роль в регуляции Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь внутриклеточных процессов. Обычно, измененный статус той либо другой макромолекулы поддерживается благодаря системам из пары ферментов, один из которых присоединяет определенную группу к молекуле, а другой – отрезает. Таковы, к примеру, системы протеинкиназ и фосфатаз, ацетилтрансфераз и деацетилаз. Убиквитин-конъюгирующая система устроена еще труднее и работает по каскадному принципу. Она состоит из Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь так именуемых ферментов Е1 (убиквитин-активирующий фермент, либо Uba), E2 (убиквитин-конъюгирующий фермент, либо Ubc) и Е3 (убиквитин-лигаза, либо Ubl). Сначало числилось, что система эта построена по принципу пирамиды: количество изоформ ферментов подчиняется правилу Е1 < E2 < E3. Подразумевали, что 1-ые стадии, общие для всех конечных субстратов, не нуждаются Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь в специфики, и потому могут опосредоваться в принципе одним и этим же ферментом Е1, а специфика взаимодействия с субстратом обеспечивают Е2 и в основном Е3. Но к истинному времени идентифицировано огромное количество вариантов Е1, как канонических, так и неканонических, и больше распространяется представление, в согласовании с которым вся цепочка Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь из 3-х ферментов может иметь довольно высшую специфика по отношению к белку-мишени.

Реакция убиквитинирования проходит в несколько стадий. На первой Е1 связывает MgАТФ и свободный убиквитин. За счет гидролиза АТФ формируется тиоэфирная связь меж Е1 и карбоксильным концом убиквитина. На 2-ой стадии Е1 передает связанный убиквитин Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь на SH-группу Е2 также с образованием тиоэфирной связи. На третьей стадии Е2-убиквитин образует комплекс с убиквитин-лигазой Е3, с которой уже связан белок-мишень. Заключительная стадия сводится к переносу убиквитина с Е2 на лизиновый остаток мишени. Считается, что повторение 3 и 4 стадий приводит к росту убиквитиновой цепи, хотя есть Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь догадки и о существовании специального фактора элонгации Е4, функция которого как раз и состоит в удлинении цепочек. Остается также неясным, каким образом регулируется выбор лизина для присоединения убиквитина, в том числе и к нескольким разным лизинам мишени при поли- и мультубиквитинировании

Убиквитин-лигазы делятся на два огромных семейства Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь. Это ферменты ЕЗ, содержащие каталитический RING домен (Really Interesting New Gene), и НЕСТ-доменные ЕЗ лигазы (Homologous to E6-associated protein C-Terminus).

Функция RING-доменных убиквитин-лигаз заключается в координации обоюдного положения белка-мишени и Е2-убиквитин-тиоэфирного комплекса таким макаром, чтоб обеспечить прямую передачу убиквитина от Е2 к белку. В Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь эту группу входят как мономерные белки (к примеру, с-Cbl), так и многокомпонентные белковые комплексы, к примеру, куллин-содержащие убиквитинлигазные комплексы (SCF-комплексы), для которых любая из молекулярных функций обеспечивается специфичной субъединицей. Таким макаром, группа эта очень неоднородна.

Напротив, все НЕСТ-доменные ЕЗ лигазы - мономерные белки с относительно обычной Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь структурной организацией. В отличие от RING-доменных убиквитин-лигаз, при содействии меж Е2 и НЕСТ-доменной ЕЗ происходит перенос молекулы убиквитина поначалу на остаток цистеина активного центра домена НЕСТ. После чего ЕЗ НЕСТ-убиквитин ведет взаимодействие с белком-мишенью, и передает на него убиквитин.

Вне зависимости от степени трудности Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь структурной организации убиквитин-лигаз, как RING-, так и HECT-доменных, многие из их полифункциональны. Это свойство поддерживается наличием ряда доменов, не участвующих в реакции убиквитинирования.

Не считая Е1-Е3 белков, в систему убиквитинирования входят так именуемые DUBs, либо деубиквитинирующие белки, отщепляющие убиквитин от белков-мишеней и возвращающие его в Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь пул свободного внутриклеточного убиквитина. Существует DUB-активность, ассоциированная с протеасомами, и деубиквитинирование белка нужно для следующего его протеасомного гидролиза. Известны также несколько деубиквитинирующих ферментов, не связанных с протеасомами. В итоге совместного деяния Е1-Е3 ферментов и DUBs состояние убиквитинирования определенного белка может быть очень лабильным, транзиторным, и набор измененных Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь лизинов, как и длина цепочек (другими словами то, что можно именовать «профилем убиквитинирования»), способны очень стремительно изменяться. Это делает механизм убиквитинирования тонко настраиваемой системой мечения белков с широкими функциями.

Если система убиквитинирования (по последней мере, частично) ориентирована на мечение белков, то должны существовать ответные механизмы определения Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь этой метки. Вправду, многие белки содержат так именуемые UBD-домены (ubiquitin-binding domains), различающиеся по структуре и сродству к цепочкам разной длины либо участкам связи меж примыкающими убиквитинами в цепочке. По-видимому, обилие таких доменов довольно велико. В неких белках обнаружены кластеры UBD. Любопытно, что убиквитин-узнающие домены не только Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь лишь обеспечивают специфика взаимодействия убиквитинированного белка с его партнерами в процессе какого-нибудь процесса, да и способны защищать его от протеасомной деградации. Не считая того, UBD могут участвовать в регуляции активности белков: в случае, если таковой домен локализован в конкретной близости от активного центра либо свзязывающего домена белка, ассоциация его с Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь убиквитином может работать как чисто механическое препятствие его взаимодействия с субстратом. Таким макаром, убиквитинирование может выступать и в качестве негативного регулятора определенных взаимодействий.

7.3. УБИКВИТИНИРОВАНИЕ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭНДОЦИТОЗА. УБИКВИТИНИРОВАНИЕ
БЕЛКОВ-ГРУЗОВ И РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ

Как упоминалось выше, модификация убиквитином многих белков была известна уже издавна, но ее функциональное значение Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь оставалось неясным. Открытие убиквитин-зависимого механизма деградации белков почти все растолковало, но в то же время вызвало бессчетные вопросы. Так, оказалось, что убиквитиниррованию подвергаются не только лишь цитоплазматические белки, да и многие белки, локализованные в плазматической мембране, в том числе составляющие неких ионных каналов, транспортеров, сенсоры Т-клеток Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, некие сенсоры, сопряженные с G-белками, рецепторные тирозинкиназы и ряд других. Смущало также то, что хотя нрав окрашивания антиубиквитиновыми антителами измененного сенсора ЭФР либо ФРВТ на электорфорезе был неотличим от нрава окрашивания всех других полиубиквитинированных белков, деградация этих рецепторов в лизосомах была накрепко установлена и задокументирована, хотя полиубиквитинирование рассматривалось конкретно Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь как сигнал протеасомной деградации.

Последующие исследования проявили, что убиквитинирование рецепторных белков не имеет непосредственного отношения к протеасомам, а связана с регуляцией эндоцитозного пути (рис. 35). Выяснилось, что белки-грузы, обычно, не поли-, а мультубиквитинированы.

Самым изученным с этой точки зрения является сенсор ЭФР. Понятно, что главные остатки лизинов, по Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь которым проходит

Рис. 35. Мультиубиквитинирование мембранного белка
нужно для доставки его во внутренние везикулы МВТ,
что ведет к его деградации в лизосомах, тогда как
неубиквитинируемый сенсор остается во наружной
мембране и рециклирует

модификация, локализуются в области тирозинкиназного домена, не затрагивая С-терминальной регуляторной области. Большая часть рецепторных тирозинкиназ убиквитинируется RING-доменной убиквитин-лигазой с-Cbl Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь и ее изоформами, связывающейся с определенным фосфорилированным тирозиновым остатком сенсора после активации последнего. Понятно, что по мере созревания эндосом направляемый на деградацию груз попеременно ведет взаимодействие с 4-мя сортирующими комплексами ESCRT0-III (Endosomal sorting complex required for transport). Нарушение этого взаимодействия перекрывает как созревание эндосом, так Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь и сортировку груза на путь деградации. Оказалось, что определенные составляющие этих комплексов владеют UBD-доменами, что обеспечивает их взаимодействие с убиквитинированным грузом. Убиквитин-узнающие домены сортирующих комплексов принадлежат к различным типам - UBA, UIM и UEV, что может означать избирательное сродство определенного комплекса к определенному профилю убиквитинирования груза. Изменение профиля Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь убиквитинирования обеспечивается, с одной стороны, неизменной работой ассоциированной с активированным сенсором убиквитин-лигазы с-Cbl, а с другой стороны – активностью деубиквитинирующих ферментов. Два таких фермента, – AMSH и UBPY, – были идентифицированы на эндосомах. Может быть, что изменение профиля убиквитинирования сенсора позволяет координировать работу комплексов, но это предположение еще нуждается в Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь подтверждениях.

Как считают, основная функция сортирующих комплексов связана с концентрированием убиквитинированных грузов в областях мембраны эндосомы, из которых потом будут формироваться внутренние пузырьки МВЭ. Конкретно перед попаданием в пузырек сенсор деубиквитинируется, а убиквитин вновь врубается в оборот. Таким макаром, мультубиквитинирование мембранных белков может рассматриваться как сигнал доставки грузов во внутренние Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь пузырьки мультивезикулярных тел.

Моноубиквитинирование также связано с регуляцией эндоцитозного пути. Во-1-х, есть данные о том, что для рекрутирования сенсора в окаймленную ямку довольно присоединения к нему одной молекулы убиквитина, но это продемонстрировано только на модельных ситемах. Во-2-х, моноубиквитинированию (по всей видимости, с-Cbl-зависимому) подвергаются некие Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь вспомогательные белки и составляющие сортирующих комплексов, что приводит к их «выключению» (рис. 36). Так, заякоривание сенсора ЭФР в области окаймленной ямки обеспечивает его взаимодействие с комплексом Eps15/epsin, взаимодействующим с С-терминальным регуляторным доменом

.

Рис. 36. Моноубиквитинирование вспомогательных белков
производит их регуляцию по механизму оборотной связи

сенсора. После формирования и отщепления ОЯ эти белки моноубиквитинируются Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, в итоге чего теряют активность, и уходят в цитоплазму, освобождая интернализованный сенсор для новых взаимодействий. Таким макаром, моноубиквитинирование тут выступает как механизм негативной регуляции молекулярных взаимодействий.

Как упоминалось выше, убиквитин-лигазы, обычно, полифункциональны. Основная убиквитинлигаза эндоцитозного пути, c-Cbl, является броским тому примером (рис. 37). Ее N-терминальный Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь участок содержит так именуемый TKB (tyrosine kinase binding) домен, обеспечивающий прямое взаимодействие с фосфорилированными по тирозину рецепторами-мишенями. Дальше следует маленький линкерный участок и RING-домен, отвечающий за взаимодействие с Е2, т. е. за реакцию убиквитинирования как таковую. С тем же участком может связываться белок Sprouty, блокирующий убиквитинирование. К Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь связанным с убиквитином процессам относится также UBA-домен, локализованный конкретно на С-конце молекулы.

Рис. 37. Доменная организация убиквитин-лигазы с-Cbl.
На схеме представлены: (a) – белки, взаимодействующие с
разными доменами с-Cbl. б – сенсор ЭФР связывается
с с-Cbl при помощи 3-х веб-сайтов, а убиквитинированию
подвергаются остатки лизина в Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь ТК-домене сенсора

Чуток более половины белка занимают домены, отвечающие за белок-белковые взаимодействия по механизму, опосредуемому SH3- и SH2–доменами – PRD-домены и бессчетные веб-сайты тирозинового фосфорилирования, из которых три мажорных.

1-го взора на перечень партнеров с-Cbl довольно, чтоб представить, в каких различных процессах этот белок Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь участвует. Здесь и адаптерные белки, и киназы Src-семейства, и PI3-киназа p85. Любопытно, что как р85, так и Src-киназа может связываться с с-Cbl 2-мя различными методами. Сенсор ЭФР имеет три веб-сайта, один из которых, фосфотирозин Y1045, ведет взаимодействие с с-Cbl через ее ТКВ-домен Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, а два дополнительных, Y1068 и Y1101 – через регуляторный С-терминальный домен убиквитин-лигазы. Связывание через Y1045 является нужным для убиквитинирования сенсора и его лизосомной деградации. Функции же 2-ух других веб-сайтов неясны.

Не так давно появились данные об ассоциации с-Cbl с микро-трубочками, также о возможности убиквитин-лигазы Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь конкурентно теснить деацетиалазу HDAC6, поддерживающую динамичность плюс-конца микротрубочек, с 1-го и такого же связывающего веб-сайта сенсора ЭФР.

До сего времени непонятно, как связана работа c-Cbl в качестве убиквитин-лигазы и в качестве адаптера, но разумеется, что роль в почти всех взаимодействиях расширяет способности ее регуляции.

7.4. УБИКВИТИН Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ,
ИХ РОЛЬ В ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССАХ.
СВЯЗЬ УБИКВИТИН-ЗАВИСИМЫХ Устройств СОРТИРОВКИ БЕЛКОВ С НАПРАВЛЕНИЕМ ИНВАГИНАЦИИ МЕМБРАНЫ

Не считая убиквитина, в клеточках млекопитающих к истинному моменту идентифицировано около 10 так именуемых убиквитин-подобных белков (ubiquitin-like proteins, UBL), присоединение которых к мишеням приводит к разным эффектам. Представителями этого стремительно возрастающего семейства являются Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь SUMO, Nedd8, ISG15 и Atg8. Невзирая на отсутствие гомологии в последовательностях различных UBL, принцип их работы идентичен. Их присоединение к мишеням также опосредуют системы ферментов Е1-Е3, хотя и тут гомология с компонентами убиквитинирующего каскада фактически отсутствует. Исследования функций UBL и устройств их регуляции еще далеки от окончания.

Посреди Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь всех UBL в рамках нашей темы больший энтузиазм представляют убиквитин-подобные белки семейства Atg8 (autophagy-related proteins), связанные с формированием аутофагосом. Выделяют несколько типов аутофагии, какой-то из них - макроаутофагия – процесс заключения в двойную мембрану части цитоплазмы клеточки с содержащимися в ней агрегатами белков либо органеллами и следующая Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь деградация содержимого в лизосомах. Аутофагия стимулируется при действии на клеточку разных стрессорных причин, к примеру, голодания, и развивается в течение нескольких часов. До сего времени идут споры о происхождении аутофагосомной мембраны, и пальму первенства держат мембраны аппарата Гольджи и ранешние эндосомы. Для формирования мембраны аутофагосомы нужна конъюгация убиквитин-подобного Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь белка LC3B (microtubule associated protein 1 light chain 3), гомолога дрожжевого Atg8, экспрессирующегося в клеточках млекопитающих, с липидом фосфатидилэтаноламином, локализованным в мембране предшественника (фагофора) аутофагосомы. Эта реакция осуществляется по каскадному приципу с ролью Atg7 (E1-подобная активность), Atg 3 (E2) и Atg12-Atg5-Atg16L (Е3–лигазная активность). В аутофагосоме LC Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь3 в связанном виде (LC3II) участвует в селекции груза для деградации, также, может быть, в заякоривании и слиянии мембран аутофагосомы с лизосомами либо другими органеллами.

Убиквитин-зависимые механизмы, по всей видимости, вовлечены также в образование «in-out» инвагинаций, так как составляющие той же системы, которая обеспечивает формирование внутренних пузырьков МВТ Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, участвуют в сборке вирусных частиц на плазматической мембране. Так, показано, что для упаковки вирусов HIV-1 нужно присутствие белка TSG101, компонента сортирующего комплекса ESCRT-I. Формирование аутофагосомы с двойной мембраной также припоминает формирование внутреннего пузырька МВЭ, в случае, когда этот «пузырек» имеет площадь, равную примерно половине площади начальной мембраны.

7.5. УБИКВИТИНИРОВАНИЕ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь семейства убиквитин-зависимых систем в текущее время является «горячей точкой» клеточной биологии. Не все составляющие системы идентифицированы, далеки от осознания механизмы ее функционирования, очень многообразны уже известные функции. С учетом убиквитин-подобных белков эта модификация оказывается даже более всераспространенной в клеточках эукариот, чем фосфорилирование. Все же, можно гласить Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь о том, что поли- и мультиубиквитинирование вправду в итоге является «меткой смерти» для измененного белка, в первом случае – в протеасомах, а во 2-м – в лизосомах. К истинному моменту нельзя утверждать, что убиквитинирование – это единственный метод для белка-груза попасть в лизосомы: в дрожжах найдены несколько белков, которые деградируют в лизосомах, не Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь подвергаясь за ранее убиквитинировованию. Все же, перечень белков и белковых комплексов, использующих убиквитин-зависимый путь доставки в лизосомы, возрастает с каждым деньком, и возникает больше данных о сложных отношениях снутри убиквитин-подобного семейства в целом.

8. АДФ-РИБОЗИЛИРОВАНИЕ

Очередной посттрансляционной модификацией является присоединение к макромолекулам остатка АДФ-рибозы либо ее цепочек Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, добавление и удаление которых осуществляется надлежащими ферментами, а источником является NAD+. Субстраты АДФ-рибозилирования очень многочисленны, а его эффект многозначен. Так, АДФ-рибозилирование тримерного ГТФ-связывающего белка Gс холерным токсином подавляет активность его ГТФазы, стабилизируя Gс в его активном состоянии, стимулируя аденилатциклазу и тем увеличивая синтез повторяющегося АМФ. В Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь противоположность этому АДФ-рибозилирование Gi коклюшным токсином выравнивает Gi в связанном с ГДФ неактивном состоянии; в итоге этого коклюшный токсин предутверждает гормональное подавление аденилатциклазы. В общем случае можно гласить о том, что АДФ-рибозилирование модулирует активность разных ферментов.

Целый ряд токсинов провоцирует АДФ-рибозилирование разных мишеней, что и опосредует Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь токсический эффект. Вовлечение этой модификации в регуляцию везикулярного транспорта имеет несколько качеств. Во-1-х, таковой принципиальный регулятор везикулярного транспорта, инициирующий формирование нескольких типов окаймлений, как малая ГТФаза ARF1 (ADP-ribosylation factor1) была сначало идентифицирована как ко-фактор АДФ-рибозилтрансферазы холерного токсина. Конкретно данный факт отражен в Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь заглавии малой ГТФазы, и только потом выяснилась ее роль в регуляции везикулярного транспорта в норме.

Во-2-х, значимость АДФ-рибозилирования стала ясна после того, как в конце 1980 гг. было продемонстрировано действие макролидного лактона Брефельдина А (BFA) на динамику мембран компартментов биосинтетического пути. Вправду, эффект оказался очень драматическим и очень зрелищным Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь: практически через пару минут после прибавления к клеточкам этого антибиотика начинается насыщенная тубуляция мембран аппарата Гольджи в направлении клеточной периферии, завершающаяся резвым слиянием с мембранами ЭПР и полным растворением в их (рис. 38).


Рис. 38. Брефельдин А вызывает тубуляцию мембран
Гольджи по направлению к ЭПР и полное смешение
мембран 2-ух компартментов

Естественно Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь, встал вопрос о механизмах таковой реорганизации. В первых работах с BFA нашли, что он перекрывает ARF1 в ГДФ-связанной форме, и препятствует тем сборке СОРI-окаймления. Но, это должно было бы препятствовать возвратимому транспорту мембран АГ в ЭПР, опыты же демонстрируют быстрее обратный эффект. Тогда было изготовлено предположение, что роль окаймления Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь (по последней мере, СОРI) заключается, а именно, в препятствовании неконтролируемой тубуляции мембран.

Последующие исследования, но, привели к отказу от этой догадки. Так, нашли, что эндосомы и транс-Гольджи в присутствии BFA не тубулируются, а коллапсируют в области ЦОМТ, в то время как лизосомы медлительно (в течение часов) тубулируются Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь. Феномен заключался в том, что на лизосомах нет ни ARF1, ни COPI. Не считая того, была найдена линия клеток Ptk1, в каких аппарат Гольджи не разбирается в ответ на добавление BFA, хотя COPI снимается с мембран. Как следует, поведение ARF1 и COPI не являются предпосылкой эффекта BFA.

Оказалось, что в Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь клеточках, истощенных по NAD+ (источнику АДФ-рибозы), ARF1 и COPI уходят с мембран при действии BFA, а Гольджи остается интактным. Таким макаром, причина тубуляции мембран кроется в АДФ-рибозилировании некоторых мишеней, препятствующих тубуляции. Было найдено, что BFA провоцирует АДФ-рибозилирование 2-ух белков – BARS50 и глицерофосфат-дегидрогеназы GAPDH .

О Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь определенных механизмах роли этих 2-ух белков в регуляции тубуляции понятно малость. Свежие исследования проявили, что CtBP1-S/BARS локализован на тубулярных мостиках, связывающих стопки цистерн аппарата Гольджи в единую ленту, и способен ацилировать лизофосфатидную кислоту LPA, т. е. видоизменять мембранные липиды. Любопытно, что этот белок участвует также Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь во фрагментации АГ перед митозом, и его нокаут перекрывает вход в митоз. Эффект ингибитора АДФ-рибозилирования дикумарина (dicumarol), вызывающего селективное разрушение тубулярных компонент аппарата Гольжди и ингибирование транспорта, находится в зависимости от активности BARS, при всем этом искусственное пре-АДФ-рибозилирование цитозоля препятствует разрушению тубул Гольджи дикумарином. Все это свидетельствует Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь о довольно сложном механизме деяния BARS, который может как поддерживать тубуляцию в строго определенных участках мембраны, так и обеспечивать ee фрагментацию (fission) в строго определенный момент, тогда как при нарушении обычной регуляции этих функций в итоге АДФ-рибозилирования тубуляция воспринимает неконтролируемый нрав.

В связи с общими механизмами тубуляции мембран представляется Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь значимой способность BARS видоизменять липиды. То, что липиды участвуют в этом процессе, непременно, также как и то, что они работают под контролем разных сигналов. В пользу этого свидетельствует то, что в присутствии вортманнина, ингибитора PI-3 киназ I- и III-го классов, происходит тубуляция рециклирующих эндосом, тогда как организация мембран Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь аппарата Гольджи не нарушается (рис. 32, б).

Идентификация глицерофосфатдегидрогеназы GAPDH в качестве мишени BFA несколько неожиданна, так как этот белок рассматривался как классичесикий гликолитический фермент. Но последние данные молвят в пользу его мультифункциональности и наличии активностей, хороших от метаболической. Эти активности могут регулироваться как локализацией GADPH, так и Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь его модификациям. К примеру, этот фермент способен вести взаимодействие с микротрубочками, обеспечивая связь меж Rab2 и динеином. Хотя BFA приводит к перераспределению мембран АГ и в отсутствие микротрубочек, в норме тубулирующаяся мембрана «опирается» на МТ. Так происходит и с тубулярными участками ЭПР.

9. РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА
В ПОЗИЦИОНИРОВАНИИ ОРГАНЕЛЛ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССАХ

9.1. ТИПЫ ЦИТОСКЕЛЕТА, ИХ Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь Главные
Характеристики

Как понятно, поддержание формы клеточки, способность изменять ее при действии разных наружных причин, в том числе механических, клеточная подвижность и клеточное деление обеспечивается цитоскелетом. Состоя из длинноватых белковых полимеров, цитоскеле́т практически является очень оживленным внутриклеточным каркасом. Он важен также для позиционирования (поддержания обоюдного расположения Фосфоинозитиды и экзоцитозный путь) органелл и везикулярного транспорта.


fotokonkurs-zaochnoe-uchastie-make-up-fashion-look.html
fotolyuminescenciya-zakon-stoksa.html
foton.html